Внутрішньо неупорядковані N-кінцеві відрізки білків можуть не лише позначати їх на руйнування, а й захищати від нього. Це показала робота, коротко описана у виданні Scienmag: такі ділянки на початку білкового ланцюга пригнічують котрансляційну деградацію в клітинах дріжджів та людини.
Котрансляційна білкова деградація знищує значну частину новонароджених поліпептидів ще під час синтезу на рибосомі або одразу після виходу з неї, до завершення згортання. Раніше гнучкі, неструктуровані послідовності розглядалися як дегрони — «мішені» для протеасоми. Однак нові дані свідчать: певні неупорядковані N-кінцеві фрагменти можуть діяти як переносні стабілізувальні елементи.
Як неупорядкована ділянка Rpl8A захищає білок
Автори зосередилися на дріжджовому рибосомному білку Rpl8A, для якого було показано, що сигнали котрансляційного руйнування містяться повністю в перших 100 амінокислотах. Моделювання структури за допомогою AlphaFold, JPrep і Metapredict показало, що ці 100 амінокислот поділяються на дві частини: перші 50 утворюють повністю неупорядковану ділянку, тоді як амінокислоти 51–100 формують дві альфа-спіралі, які взаємодіють з C-кінцевими залишками.
Щоб зрозуміти, яка з цих частин відповідає за деградацію, дослідники створили химерні білки (конструкти), приєднавши окремі фрагменти до мишачого дигідрофолатредуктази (DHFR) з епітопним тегом. DHFR після синтезу зазвичай дуже стабільний, але в дріжджах зазнає значної котрансляційної деградації.
Аналіз за допомогою цикло гексимід-чейз експериментів та імуноблотингу показав: додавання неупорядкованих перших 50 амінокислот Rpl8A не стимулювало руйнування, а навпаки, різко підвищувало рівень накопичення гібридного білка порівняно з «голим» DHFR. Натомість приєднання структурованого спірального сегмента 51–100 викликало швидку як ко-, так і посттрансляційну деградацію та дуже низькі сталi рівні білка.
Кількісний RT-PCR показав, що рівень мРНК для всіх конструкцій однаковий, отже відмінності зумовлені саме виживанням білка, а не активністю транскрипції. Цікаво, що захисний ефект неупорядкованого N-кінця був співставний зі стабілізацією за рахунок N-кінцевого «кришкування» убіквітином.
Захист рибосомних білків і специфічність дії
Далі неупорядкований 50-амінокислотний лідер Rpl8A протестували на ендогенних рибосомних білках, що сильно руйнуються котрансляційно. Білок Rps31 в нормі синтезується як попередник із N-кінцевим убіквітином, який запобігає передчасній деградації. Без цього убіквітинового «ковпака» новий Rps31 швидко знищується.
Приєднання неупорядкованого фрагмента Rpl8A до N-кінця нефузійного Rps31 відновлювало його накопичення до рівня природного убіквітинового попередника, при незмінному рівні мРНК. Коли ж із самого Rpl8A видалили перші 50 амінокислот, сталий вміст білка впав приблизно на 50 % без змін його посттрансляційного періоду напівжиття чи рівня транскрипту. Це показує, що власний неупорядкований N-кінцевий фрагмент є критичним для захисту Rpl8A від котрансляційного руйнування.
Щоб перевірити, чи діє такий лідер як універсальний «підсилювач» синтезу, командa протестувала білки, які й так практично не зазнають котрансляційної деградації — рибосомний білок Rps12 та зелений флуоресцентний білок (GFP). Приєднання до них 50-амінокислотного фрагмента Rpl8A не підвищувало сталий рівень білка, а отже не збільшувало швидкість трансляції чи ініціації, а лише захищало саме ті субстрати, які схильні до котрансляційного руйнування.
Також неупорядкований лідер з’єднали з відомим переносним дегроном із транскрипційного фактора Rpn4. У цьому випадку лідер підвищував початкові рівні білка за рахунок зменшення котрансляційних втрат, але не заважав подальшому посттрансляційному руйнуванню. Отже, його захисна дія обмежується саме фазою синтезу.
Роль шаперонів Hsp70 і мінімальний захисний мотив
Щоб з’ясувати механізм дії, дослідники провели афінне очищення з подальшою LC–MS/MS для пошуку білків, які зв’язуються з неупорядкованим лідером. У дріжджових екстрактах порівнювали глутатіон-S-трансферазу з Flag-тегом та ту ж саму ГСТ, з’єднану з 50-амінокислотним фрагментом Rpl8A.
У зразку з неупорядкованим лідом на гелях виявили дві додаткові чіткі смуги. Мас-спектрометрія показала, що верхня смуга належить шаперонам підродини SSA Hsp70 (Ssa1, Ssa2, Ssa4), а нижня — членам підродини SSB (Ssb1, Ssb2). Повторення експерименту в мутантному штамі, позбавленому генів SSB1 і SSB2, повністю усунуло нижню смугу, що підтвердило специфічне зв’язування Ssb із лідером.
Оскільки компонент рибосом-асоційованого комплексу Zuo1 координує залучення Ssb до нових ланцюгів, автори перевірили його роль. У штамі без Zuo1 кількість Ssb, що співосаджувався з неупорядкованим конструктом, помітно зменшилася, що узгоджується з котрансляційним зв’язуванням Ssb з лідером під час виходу поліпептиду з рибосоми. Водночас значна частина Ssb все ще приєднувалася й без Zuo1, що свідчить про наявність альтернативних шляхів рекрутингу або здатність Ssb безпосередньо зв’язуватися з уже сформованими неупорядкованими ділянками.
Далі команда дослідила, який мінімальний фрагмент лідера потрібен для захисту. З огляду на те, що Hsp70 зазвичай розпізнають неупорядковані мотиви довжиною 5–7 амінокислот, вчені систематично вкорочували 50-амінокислотний фрагмент і приєднували його до DHFR. Виявилося, що вже 10-амінокислотна послідовність забезпечує повну стабілізацію, еквівалентну повному лідеру, а семи амінокислот достатньо для повного захисту. Шести — вже ні: такий варіант не стабілізував білок і поводився як незахищений DHFR.
Щоб з’ясувати, чи важлива конкретна первинна послідовність, створили два 10-амінокислотні мутанти, у яких гідрофобні та позитивно заряджені залишки замінили полярними. Обидва варіанти так само ефективно пригнічували котрансляційну деградацію, як і вихідний фрагмент. Це вказує, що ключову роль відіграють саме неупорядкованість і гнучкість, а не конкретний амінокислотний мотив.
Чи є захист загальною властивістю неупорядкованих N-кінців
Щоб перевірити, чи котрансляційний захист — загальна властивість різних неструктурованих N-кінцевих ділянок, дослідники відібрали дев’ять додаткових білків дріжджів з неупорядкованими N-кінцями за моделями AlphaFold у базі Saccharomyces Genome Database. Десятиамінокислотні N-кінцеві фрагменти білків Ape2, Spn1, Ero1, Put1, Bgl2, Sso2, Hrk1, Mrps9 і Rck2, які природно майже не деградують котрансляційно, по черзі з’єднували з DHFR.
Імуноблотинг показав, що всі дев’ять фрагментів пригнічували котрансляційне руйнування, збільшуючи сталий вміст DHFR у 1,7–3,5 раза порівняно з контролем без лідера. При цьому вирівнювання послідовностей продемонструвало майже повну відсутність подібності між ними, а деякі фрагменти складалися переважно з полярних амінокислот. Це підтверджує: внутрішньо неупорядковані N-кінці широко функціонують як захисні елементи проти руйнування нових ланцюгів під час синтезу.
Консервація механізму в клітинах людини та можливі застосування
Щоб з’ясувати, чи цей механізм зберігся вищими еукаріотами, вчені дослідили людського гомолога Rpl8A — білок hRpl7A, який має 55 % ідентичності послідовності з дріжджовим. Аналіз AlphaFold виявив у нього N-кінцеву неупорядковану ділянку з перших 55 амінокислот.
Експресія укороченого варіанту hRpl7A без амінокислот 1–54 у клітинах ниркової лінії HEK293 різко знижувала сталий рівень цього білка, при тому що кількість мРНК і посттрансляційна стабільність (за даними цикло гексимід-чейз аналізу) не змінювалися. Отже, так само як у дріжджів, N-кінцева неупорядкована ділянка захищає білок саме від котрансляційної деградації.
Додатково 55-амінокислотний лідер hRpl7A приєднали до N-кінця людського трансмембранного регулятора муковісцидозу (CFTR) — багатоспірального мембранного білка, відомого своєю схильністю до неправильного згортання і передчасного руйнування. У клітинах це призвело щонайменше до п’ятикратного підвищення рівнів як незрілої (з ядровим глікозилюванням), так і зрілої (з комплексним глікозилюванням) форм CFTR.
Експерименти з ензиматичною деглікозиляцією підтвердили коректну обробку білка і показали, що неупорядкований лідер знижує котрансляційне руйнування CFTR більш ніж на 80 %. Це вказує на потенційну можливість використовувати такі N-кінцеві неупорядковані ділянки для «порятунку» терапевтично важливих, але погано фолдувальних білків.
Водночас автори підкреслюють, що захисний механізм не є універсальним: деякі білки, як-от Rpn9, і без неупорядкованих лідерів уникають котрансляційної деградації, тоді як інші, наприклад Utp25, можуть активно руйнуватися, попри їхню наявність. Попри ці обмеження, стратегічне додавання внутрішньо неупорядкованих N-кінців уже виглядає багатообіцяючим інструментом для тонкого налаштування якості білків у клітині.