Пандемия COVID-19 продолжает бушевать, поэтому массовому тестированию сейчас уделяют особое внимание во многих странах. Считается, что самый надежный тест на коронавирус – это ПЦР-тест. В этом материале разбираемся, что такое полимеразная цепная реакция и по какой схеме работает ПЦР-тест.
Что такое ПЦР
Итак, полимеразной цепной реакцией (сокращенно ПЦР) называется распространенный лабораторный метод, с помощью которого можно создать множество копий нужной области ДНК.
Этим фрагментом ДНК может быть все, что интересует исследователя. Например, ген, функцию которого хочет понять ученый, или генетический маркер, который используют судебные эксперты для сопоставления биологического материала с места преступления с биоматериалом подозреваемых.
Суть метода заключается в том, чтобы получить достаточное количество копий нужной области ДНК, чтобы ее можно было обнаружить визуально, анализировать или проводить какие-либо другие манипуляции.
Метод ПЦР используется в молекулярной биологии, медицинской диагностике и многих смежных областях, а также в экологических исследованиях.
Полимераза Taq
Для репликации (синтеза дочерней молекулы) ДНК в живом организме требуется ДНК-полимераза. Этот фермент необходим и для проведения ПЦР. Полимераза участвует в формировании новых цепочек ДНК, задействуя существующие как «шаблон».
Для ПЦР обычно используют Taq-полимеразу. Она получила свое название в честь термостойкой бактерии Thermus aquaticus, из которой эту полимеразу было выделено.
Бактерия живет в горячих источниках, соответственно и ее ДНК-полимераза очень термостойкая и проявляет наибольшую активность при 70 °C. Благодаря своей термостойкости полимераза Taq идеально подходит для проведения ПЦР, так как для денатурирования нужного участка ДНК или разделения его цепочек требуется воздействие высоких температур.
Taq-полимераза способна производить ДНК лишь при условии, что ей задан так называемый праймер. Речь о последовательности нуклеотидов, которая обозначает отправную точку для синтеза ДНК.
При проведении ПЦР исследователь обозначает праймерами ту часть ДНК, которая должна копироваться (амплифицироваться).
Праймеры для ПЦР – это фрагменты одноцепочечной ДНК, длина которых обычно составляет около 20 нуклеотидов. В каждой ПЦР задействуется пара праймеров, они запускают реакцию, связываясь с одной из двух нитей ДНК, а точнее той ее части, которую нужно скопировать.
Проведение ПЦР
Итак, главные составляющие для проведения ПЦР это Taq-полимераза, праймеры, часть ДНК и ее строительные блоки нуклеотиды.
Ингредиенты собираются в пробирке вместе с кофакторами (небольшими небелковыми соединениями) и подвергаются определенному количеству повторяющихся циклов нагревания и охлаждения, что позволяет синтезировать ДНК.
Основные шаги:
- Денатурация (96 °С): реакционную смесь сильно нагревают, чтобы отделить (денатурировать) две нити ДНК друг от друга. В итоге получаются две одноцепочных ДНК для следующего этапа.
- «Отжиг» (65 °C): реакционную смесь охлаждают, чтобы праймеры могли связываться со своими комплементарными последовательностями нуклеотидов на нужном участке одноцепочечной ДНК.
- Удлинение (72 °C): температура реакции повышается, Taq-полимераза удлиняет праймеры, создавая новые цепочки ДНК.
Этот цикл обычно нужно повторить 25–35 раз, что обычно занимает 2–4 часа, – в зависимости от того, насколько длинный копируемый участок ДНК. Если реакция эффективна, целевая область ДНК может амплифицироваться от одной или нескольких копий до миллиардов.
Таким образом, при ПЦР вырабатывается такое количество искомой ДНК, которое можно обнаружить визуально. В ПЦР-тестах на коронавирус, само собой, искомым фрагментом ДНК является ДНК вируса.
Копирование может состояться только в том случае, если ДНК вируса присутствует в биологическом материале, которые исследуется.