У новій роботі, опублікованій у журналі Nature Structural & Molecular Biology, команда Чаппоні (Ciapponi) представила найдетальніший на сьогодні структурний опис канонічного репресивного комплексу Polycomb 1 (PRC1). Використавши кріоелектронну мікроскопію, дослідники показали, як цей багатокомпонентний комплекс збирається, як хімічно модифікує хроматин і яким чином знаходить свої мішені в геномі. Про це йдеться в матеріалі Scienmag.
Білки групи Polycomb є ключовими «архітекторами» клітинного ядра. Вони переводять гени у тривалий «мовчазний» стан і таким чином допомагають вирішити, у який тип клітини перетвориться стовбурова клітина. Нове дослідження дає змогу пов’язати просторову будову канонічного PRC1 з його здатністю вимикати гени та стабільно підтримувати цей стан.
Як працюють системи Polycomb у клітині
Комплекси Polycomb вперше відкрили у дрозофіли: мутації, що їх ушкоджували, призводили до радикальних змін будови тіла, що вказало на їхню роль у контролі генів розвитку. У ссавців два головні комплекси — PRC1 та PRC2 — разом пригнічують «неправильні» для певної лінії клітин гени.
PRC2 створює характерну мітку на гістоні H3 — триметильований лізин 27 (H3K27me3). Канонічний PRC1 додає доповнювальну мітку: моноубіквітинований лізин 119 на гістоні H2A (H2AK119ub). Обидві позначки пов’язані з факультативним гетерохроматином — ущільненою, але потенційно зворотною формою хроматину, що тримає регуляторні гени «вимкненими», не змінюючи саму послідовність ДНК.
Канонічний PRC1 — це не один білок, а цілий голокомплекс із кількох родин субодиниць. У його каталізаторному ядрі працює гетеродимер E3-убіквітинлігази сімейства RING — RING1A або RING1B — у парі з одним із білків PCGF, найчастіше PCGF2 або PCGF4. Навколо цього ядра збираються білки Polyhomeotic (PHC1, PHC2 або PHC3), які забезпечують вищі рівні організації хроматину, та білки родини CBX (CBX2, CBX4, CBX6, CBX7 або CBX8), що за допомогою хромодомену зчитують мітку H3K27me3, нанесену PRC2, і допомагають спрямувати PRC1 до потрібних ділянок геному.
Модульна організація зробила PRC1 надзвичайно складним об’єктом для структурних досліджень: комплекс гнучкий, може мати різний склад і динамічно взаємодіє з нуклеосомами.
Кріо-ЕМ: як вдалося побачити цілісний PRC1
Кріоелектронна мікроскопія особливо підходить для вивчення таких рухливих комплексів. Метод дозволяє швидко «заморозити» очищені білкові комплекси у тонкому шарі аморфного льоду й отримати тисячі їхніх зображень. Потім комп’ютерне сортування та усереднення різних орієнтацій дає тривимірну карту з майже атомною роздільною здатністю.
Для PRC1 технічні труднощі були значними. Комплекс потрібно очистити у максимально однорідному стані, але наявність численних паралогів субодиниць створює складову «розмитість». Чаппоні та колеги виділили чітко визначений канонічний голокомплекс і максимально використали можливості класифікації частинок та уточнення карт, щоб побачити архітектуру всієї збірки та розташування кожної субодиниці.
Отримана структура показала вражаючу «просторову економію». Каталітична субодиниця RING1 у парі з PCGF формує центральний «каркас», до якого у фіксованій конфігурації приєднуються Polyhomeotic та CBX-субодиниці. Це розташування показує, що додаткові модулі не є пасивними «пасажирами» — їхнє положення безпосередньо впливає на те, як комплекс знаходить і модифікує хроматин.
CBX із хромодоменом виступає назовні від каталізаторного ядра так, щоб «діставати» до сусідніх нуклеосом із міткою H3K27me3. Таким чином розпізнавання «коду» PRC2 напряму пов’язується з розміщенням лігази PRC1. Polyhomeotic-субодиниці розташовані так, що їхня будова узгоджується з відомою здатністю з’єднувати віддалені ділянки хроматину та сприяти його ущільненню, фізично підсилюючи пригнічення генів.
Хімічна активність і націлювання на геном
Автори не обмежилися структурою, а безпосередньо досліджували ферментативну дію. Каталітичне ядро з RING1B діє як E3-убіквітинлігаза, що переносить убіквітин від ферменту E2 на лізин 119 гістону H2A у складі нуклеосоми.
У дослідах з реконструйованими нуклеосомами та очищеними варіантами комплексу вчені вивчали, як мутації чи інші втручання в контакти між субодиницями, виявлені на структурі, впливають на моноубіквітинування H2A. Результати підтримують модель, за якою цілісний голокомплекс координує взаємодію з субстратом: каталітичний модуль має бути правильно зорієнтований відносно «кислотної ділянки» нуклеосоми — поверхні на гістоновому диску, де зв’язується RING1B, — а периферичні субодиниці стабілізують активну конформацію та створюють численні контакти, що підвищують ефективність націлювання.
Окрема увага приділена тому, як PRC1 знаходить сотні ділянок геному, які він пригнічує, зокрема CpG-острівці в ділянках промоторів генів розвитку. Поширена модель припускає комбінаторне розпізнавання: хромодомени CBX зв’язуються з H3K27me3, нанесеним PRC2, тоді як інші фактори розпізнають неметильовану CpG-ДНК.
Нова структура показує, як CBX-субодиниця орієнтована у складі голокомплексу так, щоб її хромодомен міг «сканувати» сусідні нуклеосоми, а загальна геометрія збірки дозволяє кільком слабким взаємодіям складатися в одне стабільне і специфічне зв’язування з хроматином. Такий мультивалентний дизайн пояснює, як PRC1 поєднує високу вибірковість щодо потрібних ділянок геному зі здатністю довго підтримувати їхній «мовчазний» стан упродовж клітинних поділів.
Медичне значення та подальші кроки
Помилкова робота Polycomb-комплексів пов’язана з багатьма людськими хворобами. Надлишкова експресія BMI1 — ссавцевого аналога PCGF4 — стимулює поділ клітин у низці видів раку і вважається маркером пухлинних стовбуроподібних клітин. Втрати функції компонентів Polycomb призводять до вроджених синдромів, зокрема синдромів надмірного росту, пов’язаних із білками PRC2 (EZH2, EED), а також Shashi-Penman-синдрому, де задіяні EED та EZHIP. Соматичні зміни в генах PRC1 регулярно виявляють у лімфомах, лейкозах і твердих пухлинах.
Точне розуміння послідовності збирання і механізму дії канонічного PRC1 на структурному рівні дає раціональну основу для створення терапевтичних підходів — зокрема молекул, що можуть дестабілізувати патологічні комплекси або блокувати їхню каталітичну активність.
Робота також знімає давні питання про зв’язок між будовою і функцією в біології Polycomb. Раніше біохімічні досліди описували окремі взаємодії — RING1B з PCGF, зв’язування хромодоменів CBX з H3K27me3, асоціацію Polyhomeotic з хроматином, — але залишалося неясно, як ці «фрагменти» інтегруються в цілісний голокомплекс і чи поводиться він інакше, ніж сума його частин.
Поєднавши в одному дослідженні архітектуру канонічного PRC1, ферментативні вимірювання й дані про націлювання на геном, Чаппоні та колеги надали механістичну цілісну картину, якої бракувало попереднім фрагментованим роботам. Їхня структура стає каркасом, на який тепер можна «нанести» десятиліття генетичних, біохімічних і геномних спостережень.
Надалі вчені планують дослідити за допомогою кріо-ЕМ варіанти PRC1 з іншими паралогами PCGF, CBX і Polyhomeotic, щоб з’ясувати, як різний склад визначає спеціалізацію функцій. Більш високодетальні реконструкції комплексу в комплексі з нуклеосомами мають уточнити точну геометрію перенесення убіквітину на лізин 119 H2A. Порівняння з неканонічними комплексами PRC1, які не містять CBX і використовують інші фактори рекрутингу, покаже, як еволюція налаштувала один і той самий каталітичний центр під різні стратегії націлювання.
Наразі ж структура, отримана Чаппоні та колегами, є етапною віхою: це перший повний погляд на одну з найважливіших клітинних машин пригнічення генів і наочний приклад того, як кріоелектронна мікроскопія змінює наше розуміння молекулярної логіки регуляції хроматину.